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RNA酶保護(hù)試驗(yàn)方法
時(shí)間:2015-03-13 10:52:50 作者: 來源:轉(zhuǎn)載 點(diǎn)擊:1263次

RNA酶保護(hù)法是近十年發(fā)展起來的一種全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是將標(biāo)記的特異RNA探針(32P或生物素)與待測的RNA樣品液相雜交,標(biāo)記的特異RNA探針按堿基互補(bǔ)的原則與目的基因特異性結(jié)合,形成雙鏈RNA;未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸,而待測目的基因與特異RNA探針結(jié)合后形成雙鏈RNA,免受RNA酶的消化,故該方法命名為RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)。

目錄

· 一、 RNA酶保護(hù)試驗(yàn)的介紹

· 二、試劑準(zhǔn)備

· 三、操作步驟

· 四、電泳與放射自顯影

· 五、注意事項(xiàng)

· 六、技術(shù)文檔

RNA酶保護(hù)試驗(yàn)是通過液相雜交的方式,用反義RNA探針與樣品雜交,以檢測RNA表達(dá)的技術(shù)。


一、 RNA酶保護(hù)試驗(yàn)的介紹


RNA酶保護(hù)試驗(yàn)(RNase Protection Assay,RPA) 是通過液相雜交的方式,用反義RNA探針與樣品雜交,以檢測RNA表達(dá)的技術(shù)。與Northern blot和RT-PCR比較,RPA有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):


1. 檢測靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉(zhuǎn)膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失,使靈敏度下降,而RPA將所有雜交體系進(jìn)行電泳,故損失小,提高了靈敏度。


2. 由于PCR擴(kuò)增過程中效率不均一和反應(yīng)“平臺”問題,基于PCR產(chǎn)物量進(jìn)行分析所得數(shù)據(jù)的可靠性將下降,而RPA沒有擴(kuò)增過程,因此,分析的數(shù)據(jù)真實(shí)性較高。


3.由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段,因此,部分降解的RNA樣品仍可進(jìn)行分析。


4.步驟較少,耗時(shí)短。與Northern雜交相比,省去了轉(zhuǎn)膜和洗膜的過程。


5. RNA-RNA雜交體穩(wěn)定性高,無探針自身復(fù)性問題,無須封閉。


6. 一個(gè)雜交體系中可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)探針雜交,無競爭性問題。


7. 檢測分子長度可以任意設(shè)置,靈活性大。


RPA的缺點(diǎn)是需要同位素標(biāo)記探針。


二、試劑準(zhǔn)備


1. GACU POOL:取100mM ATP.CTP.GTP各2.78μl.100mM UTP 0.06μl,加DEPC H2O至100μl。


2. 雜交緩沖液:PIPES 0.134g.0.5M EDTA(pH8.0) 20μl.5M NaCl 0.8ml.甲酰胺8ml,加DEPC H2O至10ml。


3. RNase消化液:5M NaCl 120μl.1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl.0.5M EDTA(pH8.0) 20μl.RNase A(10mg/ml) 8μl.RNase T1(250U/μl) 1μl,加DEPC H2O至2ml


三、操作步驟


(一) 反義RNA制備


可由含T7或SP6啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒為模板制備,也可以用含啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物為模板制備,本文介紹后者。


1.設(shè)計(jì)含T7啟動(dòng)子的PCR引物


由于PCR產(chǎn)物將作為合成反義RNA的模板,所以一對引物中的下游引物5’-端要含T7啟動(dòng)子序列: T7啟動(dòng)子序列為:5’-TAATACGACTCACTATAGGG

引物設(shè)計(jì)的其他要求與一般PCR引物的設(shè)計(jì)相同。PCR產(chǎn)物的長度決定了反義RNA探針的長度,具體設(shè)計(jì)時(shí)可考慮100-400bp長。最好采用巢式PCR,即先擴(kuò)增出一較長的片段,再以該片段為模板擴(kuò)增出較短的片段,以保證探針的特異性,如下圖所示


2.PCR 先用上游引物和下游引物Ⅰ進(jìn)行PCR,再以PCR 產(chǎn)物為模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7進(jìn)行二次PCR。


3.探針合成標(biāo)記與純化


在0.5ml 離心管中加入下列試劑:


RNasin (40U/μl) 0.5μl


GACU POOL GAC


(含GTP.CTP.ATP各2.75 mM,UTP 61μM) 2μl


[α-32P]UTP(10μCi/μl) 2.5μl


DTT (二硫蘇糖醇,0.1M) 1μl


5×轉(zhuǎn)錄 buffer 2μl


模板(50ng/μl) 1μl


T7 RNA 聚合酶 (15U) 1μl


混合后,短暫離心,37℃保溫1hr。


加入DNaseⅠ(10U/μl) 1μl, 37℃ 15min, 然后75 ℃ 10min以滅活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。


加入:飽和酚 50μl


氯仿 50μl


酵母tRNA(2μg/μl) 4μl


DEPC H2O 100μl


室溫下充分混勻,離心10000g×2min。取上層液置另一0 .5ml離心管中,加入100μl氯仿,混勻,離心10000g×2min。將上層液轉(zhuǎn)移至另一0.5ml 離心管中,再加入3M NaAc 10μl,預(yù)冷無水乙醇250μl,混勻后,-20℃靜置30min。4℃離心13500g×10min。棄上清液,沉淀用75%乙醇100μl洗滌,4℃離心13500g×2min, 棄上清液。室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇。加入50μl雜交緩沖液溶解沉淀,4℃下保存待用??捎媚蛩?聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測探針質(zhì)量。


(二) 雜交


1.RNA提取后溶解在雜交緩沖液中,濃度為1μg/μl。


2.取8μl RNA加入1-3μl探針(根據(jù)探針檢測結(jié)果調(diào)整) 于0.5ml 離心管中。


3.80℃保溫2min,然后40-45℃下雜交12-18hr。


(三) 消化


1.雜交管于37 ℃保溫15min,加入RNase消化液,37 ℃保溫30min。


2.加入10%SDS 10μl.10μg/μl蛋白酶K 20μl,混勻,37 ℃保溫10min。


3.加入65μl飽和酚和65μl氯仿,混勻,室溫離心,10000g×2min。


4.轉(zhuǎn)移上層液到另一0.5離心管中,加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl,再加入200μl異丙醇,混勻后,置-20℃ 30min,4 ℃離心,135000g×10min。


5.棄上清液,室溫下?lián)]發(fā)乙醇,加入5-8μl上樣緩沖液溶解沉淀。


四、電泳與放射自顯影


(一) 配制凝膠:(50ml)


40%丙烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺(19:1) 6.25ml


5×TBE 10ml


尿素 24g


加H2O至50ml


溶解后加入25%過硫酸胺50μl,TEMED 50μl,混勻,注入電泳槽中,插入梳,待膠凝固。


(二) 預(yù)電泳(50ml)


以1×TBE為上下槽電泳緩沖液,加上電壓后進(jìn)行預(yù)電泳,如果用測序電泳裝置,電壓應(yīng)達(dá)2000v以上,功率設(shè)定為100w,溫度設(shè)為50 ℃。待膠板溫度達(dá)50 ℃時(shí),暫停電泳,準(zhǔn)備加樣。


(三) 加樣


將已溶解在加樣緩沖液中的樣品80 ℃加熱2min,立即加樣到膠孔中,電泳1-2hr。(電泳條件同預(yù)電泳) 。


(四) 電泳結(jié)束


電泳結(jié)束后,打開膠板,用濾紙取下膠,覆上一層保鮮膜,放置于暗盒中,暗室紅光下,壓上一張X片,蓋上暗盒,-70℃曝光1-3天。暴光結(jié)束后,將X光片顯影.定影.水洗.晾干。


五、注意事項(xiàng)


1.本實(shí)驗(yàn)大部分為RNA操作,注意RNA酶的污染。


2.RNase消化液消化未雜交的單鏈RNA和探針RNA,當(dāng)探針與樣品之間有堿基錯(cuò)配時(shí),錯(cuò)配位點(diǎn)也將被消化,因此會產(chǎn)生片段較小的雜交片段。因此進(jìn)行PCR時(shí),采取盡量減少錯(cuò)配的措施。


3.同位素對RNA合成有一定影響,有時(shí)會產(chǎn)生非全長的探針。因此,標(biāo)記時(shí)間不宜過長。


4.RNase消化液有時(shí)會產(chǎn)生過度消化而無檢測信號,可以將消化液稀釋10-100倍后使用。


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