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赭曲霉毒素A(Ochratoxin A)ELISA檢測試劑盒說明書
【概要】
赭曲霉毒素A (Ochratoxin A)是曲霉屬和青霉屬的真菌形成的次級(jí)代謝產(chǎn)物,屬烈性的腎臟毒和肝臟毒,廣泛存在于各種食物中。谷物及其副產(chǎn)品是赭曲霉毒素A的主要來源。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明攝入了被這種毒素污染的飼料后,會(huì)發(fā)生急性或慢性中毒癥。防止污染赭曲霉毒素A的食品和飼料直接或間接地進(jìn)入人類食物鏈,加強(qiáng)對(duì)赭曲霉毒素A的檢測十分重要。
【適用范圍】
可定性、定量檢測谷物、飼料、面粉、啤酒、紅酒、飲料等樣本中的赭曲霉毒素A。
【試驗(yàn)原理】
本試劑盒采用競爭ELISA,在微孔板上預(yù)包被赭曲霉毒素A抗原,加入樣本/赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液及辣根過氧化物酶標(biāo)記的赭曲霉毒素A抗體。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的赭曲霉毒素A與預(yù)包被在微孔板上的赭曲霉毒素A抗原競爭結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的赭曲霉毒素A抗體。未結(jié)合的酶標(biāo)抗體在洗滌時(shí)被除去,再加入顯色液,讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物赭曲霉毒素A抗原的含量成負(fù)相關(guān)。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可得出相應(yīng)殘留物赭曲霉毒素A的含量。
【試劑盒靈敏度】
試劑盒靈敏度:1ppb
【交叉反應(yīng)率】
結(jié)構(gòu)類似物 交叉反應(yīng)率
赭曲霉毒素A …………………………………………………………… 100%
赭曲霉毒素B …………………………………………………………… 43%
赭曲霉毒素C …………………………………………………………… 5%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊
2. 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶:(2ml/瓶)
0ppb, 1ppb, 3ppb, 9ppb, 18ppb, 54ppb
3. 酶標(biāo)物 1瓶 …………………………………… 7ml
4. 顯色液1瓶 …………………………………… 12ml
5. 終止液1瓶 …………………………………… 10ml
6. 濃縮洗滌液(10×)1瓶 …………………… 50ml
7. 濃縮樣品稀釋液(10×)1瓶……………… 20ml
【需要而未提供的設(shè)備及試劑】
設(shè)備:
---微孔板酶標(biāo)儀450nm
---振蕩器
---粉碎機(jī)
---離心機(jī)
---微量天平
---微量移液器:單道 20μl~200μl、200μl~1000μl、多道 300μl
試劑:
---去離子水(或蒸餾水)
---二氯甲烷
---鹽酸
---NaHCO3
【試劑配制】
1. 樣品稀釋液:將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋(1份濃縮樣品稀釋液+9份去離子水)。
2. 洗滌工作液:將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋(1份濃縮洗滌液+9份去離子水)。
【樣品前處理步驟】
一、谷物與飼料(稀釋倍數(shù):2.5)
1. 稱取1g粉碎的樣品,加入0.5ml 0.13M NaHCO3,震蕩1min,
2. 加入2ml樣品稀釋液,震蕩5min;
3. 室溫下,2000g離心15min;
4. 取100μl待測。
二、果汁、啤酒、飲料(稀釋倍數(shù):1)
1. 碳酸飲料應(yīng)去除CO2(60℃水浴或振蕩去除)
2. 取2ml 樣品,加入 1ml 1mol/L HCl 振勻,加入2ml CH2Cl2 振勻 3min;
3. 室溫下,3500g離心10min;
4. 去除上層液,吸取下層1ml,加入800μl樣品稀釋液,強(qiáng)烈振蕩3min;
5. 室溫下,3500g離心10min;
6. 取480μl上層液,加入120μl甲醇,振蕩均勻,取100μl待測。
【檢測步驟】
一、 測定前須知:
1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫(20~25℃)。
2. 使用之后立即將所有試劑及剩余板條放置2~8℃,干燥環(huán)境保存有利于保持試劑穩(wěn)定性。。
3. ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA操作中的要點(diǎn)。
4. 在所有恒溫孵育過程中,避免光線照射,用蓋板膜封住微孔板。
二、操作步驟:
1. 將所需試劑及微孔板取出,放置室溫(20~25℃)30min以上,液體試劑使用前均須搖勻。
2. 取出所需數(shù)量的微孔板,將不用的微孔板與干燥劑一起重新真空密封,放置于2~8℃。不可冷凍。
3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。
4. 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl到對(duì)應(yīng)的微孔中,加入酶標(biāo)物50μl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。
6. 小心揭開蓋板膜,用洗滌工作液充分洗滌,300μl/孔,洗板5次,每次間隔30s,用吸水紙拍干。
7. 加入顯色液100μl/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。
8. 加終止液50μl/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)酶標(biāo)儀于450nm處讀取每孔OD值。
【結(jié)果判定】
1. 百分吸光率的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光率(%)= B/B0 ×100%
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0(ppb)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中赭曲霉毒素A實(shí)際量。
【注意事項(xiàng)】
1. 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有恢復(fù)到室溫(20~25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3. 每種試劑使用前均需搖勻。
4. 反應(yīng)終止液為0.5M硫酸,避免接觸皮膚。
5. 不要使用過了有效期的試劑盒;也不要摻雜使用過了有效期的試劑盒;不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
6. 儲(chǔ)存條件:
試劑盒保存于2~8℃,不能冷凍,將不用的微孔板重新真空密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的顯色劑對(duì)光敏感,因此要避光保存。
7. 試劑變質(zhì)的跡象:
顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A450nm<0.5)時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。
8. 加入顯色液后,一般顯色時(shí)間為15~30min。若顏色較淺,可延長反應(yīng)時(shí)間到35min(或更長),但不得超過40min。反之,則減短反應(yīng)時(shí)間。
9. 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
【樣品最低檢測限】
谷物、飼料 …………………………………………… 2.5ppb
果汁、啤酒、飲料 …………………………………… 1ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件:保存試劑盒于2~8℃。
保存期:該產(chǎn)品有效期為12個(gè)月。
電話:4006-099-690 郵編:100081 傳真:010-62158706 公司地址:北京市海淀區(qū)學(xué)院南路68號(hào)吉安大廈A座6層